2019年10月1日，5-羥甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究領(lǐng)域取得重要進展。2型糖尿?。═2D）的血管并發(fā)癥是導(dǎo)致2型糖尿病致殘致死的重要病因，一直缺乏一種無創(chuàng)便捷的臨床途徑實現(xiàn)血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展監(jiān)測，達到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，以提高T2D病人的整體生活質(zhì)量，減少衛(wèi)生經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
該研究入組了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技術(shù)對血漿cfDNA中表觀遺傳標(biāo)志物5hmC的分布情況進行檢測，分析5hmC標(biāo)志物與2型糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。結(jié)果表明5hmC標(biāo)志物的變化與T2D合并大血管/微血管事件具有相關(guān)性，主要涉及一些與血管生物學(xué)和糖尿病（包括胰島素耐受和炎癥反應(yīng)）相關(guān)的基因和信號通路。該研究建立的16個基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測可以準(zhǔn)確區(qū)分有并發(fā)癥和無并發(fā)癥的2型糖尿病病人[實驗組：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)臨床變量例如白蛋白尿。除此之外，還建立了13個基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測，可以進一步區(qū)分T2D合并單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥[實驗組：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同樣明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)臨床變量。該研究得出結(jié)論，5hmC標(biāo)志物反映了T2D病人大血管/微血管并發(fā)癥發(fā)生過程中的表觀遺傳變化，因而5hmC-Seal檢測技術(shù)在監(jiān)測糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生和進展方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。
試驗設(shè)計
本研究共納入62例2型糖尿病病人，包括沒有血管并發(fā)癥的病人12例，有單一血管并發(fā)癥的病人34例（24例發(fā)生大血管事件，10例發(fā)生微血管事件），以及有多種血管并發(fā)癥的病人16例。試驗收集62例病人血漿，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技術(shù)捕獲外周血cfDNA中的5hmC序列，進行二代測序，通過生物信息學(xué)分析找出并發(fā)癥組與無并發(fā)癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因，單一并發(fā)癥組和多種并發(fā)癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因。隨后利用回歸模型對差異基因進一步篩選、優(yōu)化，彈性網(wǎng)絡(luò)進一步篩選，計算加權(quán)平均分，最后得到一組具有高度靈敏度和特異性的5hmC生物標(biāo)記物，并進一步在實驗組中驗證，分析其靈敏度和特異性。并將新建立的5hmC標(biāo)志物基因組合的檢測性能與傳統(tǒng)臨床變量進行對比分析。最后對相關(guān)基因進行了信號通路分析和功能探究。
5hmC修飾水平與血管并發(fā)癥具有相關(guān)性
利用邏輯回歸模型對62例有并發(fā)癥和無并發(fā)癥2型糖尿病病人的5hmC差異水平進行分析發(fā)現(xiàn)，有并發(fā)癥2型糖尿病病人的622個差異修飾候選基因（包括上調(diào)和下調(diào)基因）的歸一化平均數(shù)要明顯高于無并發(fā)癥的病人（P<0.001），但是單一并發(fā)癥和多發(fā)并發(fā)癥病人之間沒有顯著差異。
之后將有單一并發(fā)癥或多種并發(fā)癥的50例病人用邏輯回歸模型進行了對比，發(fā)現(xiàn)多種并發(fā)癥的病人的153個差異修飾候選基因（包括上調(diào)和下調(diào)基因）的歸一化平均數(shù)要低于無并發(fā)癥病人（P<0.001）。
5hmC標(biāo)志物可區(qū)分有無并發(fā)癥患者
62例2型糖尿病病人被隨機分成訓(xùn)練組（n=31）和測試組（n=31）。利用彈性網(wǎng)絡(luò)篩選后發(fā)現(xiàn)，16基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測可以用于區(qū)分有并發(fā)癥和無并發(fā)癥的2型糖尿病病人。
基于16基因組合模型 (Detection Model 1) 的加權(quán)平均分分析，發(fā)現(xiàn)無并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)在訓(xùn)練集和測試集中都明顯低于有并發(fā)癥的病人。只考慮加權(quán)平均分的話，受試者工作特征曲線（ROC）分析表明將cutoff值設(shè)置成0.5時，在測試組中中的靈敏度為60%，特異性為100%。 5hmC標(biāo)志物可區(qū)分病人是單一并發(fā)癥還是多種并發(fā)癥 50例有并發(fā)癥的2型糖尿病病人被隨機分成訓(xùn)練組（n=25）和測試組（n=25）。利用彈性網(wǎng)絡(luò)篩選后發(fā)現(xiàn)，13基因-5hmC標(biāo)志物組合可以區(qū)分2型糖尿病病人是否發(fā)生單一并發(fā)癥或多種并發(fā)癥。 基于13基因組合模型 (Detection Model 2)， 我們計算了單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥的加權(quán)平均分，發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練集和測試集中單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)都有明顯差異。值得一提的是，有腎病并發(fā)癥和無腎病并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)也有明顯差異。利用加權(quán)平均分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)的受試者工作特征曲線（ROC）表明，在測試組中當(dāng)將cutoff值設(shè)成0.69時，靈敏度為87.5%，特異性為68.8%。 5hmC標(biāo)志物與傳統(tǒng)臨床變量/危險因子的對比 我們評估了不同臨床變量/危險因子用于監(jiān)測血管并發(fā)癥的靈敏度和特異性（見表1）。
總體來說，結(jié)果表明一些臨床變量（如尿液白蛋白、血清ALT、AST、肌酐、GGT、脂蛋白a）雖然具有一定的靈敏度和特異性，但是整體準(zhǔn)確度仍然差強人意，因此臨床需要更加準(zhǔn)確的方法。另外，我們還在訓(xùn)練組中建立5hmC和不同臨床變量的多變量組合模型進行評估，該模型加權(quán)平均分的AUC要明顯大于傳統(tǒng)臨床變量的AUC。若將這些臨床變量與加權(quán)平均分進行結(jié)合，AUC也將進一步提高。因此，該多變量模型表明加權(quán)平均分可作為一個獨立的指標(biāo)用于監(jiān)測2型糖尿病血管并發(fā)癥。
信號通路分析和功能探究 有并發(fā)癥和無并發(fā)癥病人的135個差異候選基因的功能注釋分析表明，這些基因主要富集在一些經(jīng)典的信號通路。錯誤發(fā)現(xiàn)率相關(guān)P值位于前10%和基因數(shù)目≥3的信號通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介導(dǎo)的信號通路。由IGF1R和IL-10介導(dǎo)的信號通路與胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)相關(guān)，在血管生物學(xué)和糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 Reactome相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心表明，泛素編碼基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亞基核糖體蛋白融合產(chǎn)物1(UBA52)]是候選基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要連接者。在這135個差異候選基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表現(xiàn)出與糖尿病病程相關(guān)的傾向，表明5hmC和糖尿病血管并發(fā)癥之間可能存在時間依賴性的相互作用?；诳v向時間隊列的大樣本研究，將可進一步明確5hmC變化和糖尿病持續(xù)時間之間的動態(tài)關(guān)聯(lián)。關(guān)于單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥病人的159個候選標(biāo)志基因的功能注釋研究發(fā)現(xiàn)，存在細(xì)胞-細(xì)胞連接、膠原蛋白形成、新陳代謝、細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答信號通路的富集，這些信號通路均與細(xì)胞基本功能密切相關(guān)。 研究意義 血管并發(fā)癥是三分之二糖尿病病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并發(fā)癥的發(fā)生，將極大地改善糖尿病病人的生存質(zhì)量。該研究建立了一種利用cfDNA進行2型糖尿病血管并發(fā)癥監(jiān)測的無創(chuàng)便捷方法，較目前臨床標(biāo)志物能更準(zhǔn)確地監(jiān)控血管并發(fā)癥的發(fā)生，從而提示臨床及早采取應(yīng)對措施，有效控制病情進展。 
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